2021 年 6 月 10 日，北京大学生命科学学院孔道春实验室在美国科学院期刊 PNAS 在线发表了题为“The intra-S phase checkpoint directly regulates replication elongation to preserve the integrity of stalled replisomes” 的 研 究 论 文（https://www.pnas.org/content/118/24/e2019183118）。该研究回答了过去50 年在 checkpoint（细胞周期检验点）调控维持真核细胞 DNA 复制叉稳定领域的两个核心问题：1）停顿的 DNA 复制叉为什么会不稳定，并倾向于垮塌；2）checkpoint 调控维持停顿复制叉稳定的核心分子机制是什么？

正常细胞生长过程中，基因组不稳定主要是来自于 DNA 复制错误，大约 2/3 癌症的发生被认为是由于 DNA 复制错误导致的（Tomasetti & Vogelstein (2015), Science, 347: 78-81; Tomasetti et al. (2017), Science, 355: 1330-1334），而 DNA 复制错误主要是来自于 DNA 复制叉的不稳定。DNA 复制叉主要由两部分构成（图 1）：Y 字型的 DNA 结构和 DNA 复制体 (Replisome)。DNA 复制体包含一系列与复制相关的蛋白质及蛋白质复合物，其中，最重要的是打开双链 DNA 模板的 CMG（Cdc45-MCM-GINS）解旋酶复合物，以及进行新生链 DNA 合成的 DNA 聚合酶--DNA Pol α、δ、ε 。正常移动的DNA 复制叉是相对稳定的，DNA 复制体中的 CMG 解旋酶与 DNA 聚合酶在物理及生化功能上紧密偶联。但当 DNA 复制叉遭遇复制障碍停顿下来时，停顿的 DNA 复制叉被证明是不稳定的，倾向于垮塌。

上个世纪 60 年代末，在裂殖酵母里筛选到了一株突变株，命名为 rad3-136。很快发现 rad3-136 突变株对羟基脲（Hydroxyurea (HU), 抑制 dNTPs 合成，导致 DNA 复制叉停顿）高度敏感。至此，细胞维持停顿 DNA 复制叉稳定的机制研究拉开了序幕。Rad3 及相关蛋白介导的细胞调控，于 1988 年被命名为 checkpoint 调控（Weinert & Hartwell (1988), Science, 241: 317-322）, Rad3 被归类为 ATR 激酶。过去 50 年，前后上千个实验室，用两代人的时间，发表了上万篇研究文章，证明 checkpoint 是维持停顿DNA 复制叉稳定的必需细胞调控。在checkpoint 缺失或缺陷的细胞，停顿的DNA 复制叉发生垮塌，导致 DNA 复制不能完成，及基因组的极度不稳定。但是，在试图阐明checkpoint 调控维持 DNA 复制叉稳定的机制研究方面，碰到了极大阻力，阻力主要是来自于 checkpoint 调控的靶蛋白极难被确定，已发表文章的结论也互相矛盾，导致checkpoint 调控维持 DNA 复制叉稳定的核心机制长期得不到确定。

图 1 真核细胞 DNA 复制叉及 S 期细胞周期检验点（Leman AR, Noguchi E. The replication fork: understanding the eukaryotic replication machinery and the challenges to genome duplication. Genes. 2013 Mar;4(1):1-32.）。酵母 Chk2 在高等真核生物的功能同源蛋白是 Chk1。

通过大规模的遗传筛选，孔道春实验室发现，复制解旋酶 CMG（Cdc45-MCM- GINS）复合体的一个亚基 Cdc45 的突变能极大降低（600-3000 倍）checkpoint 通路缺陷的细胞对 HU 的敏感性，暗示 Cdc45 或 CMG 复合体可能被 checkpoint 调控。然后， 通过一系列遗传及生化分析，证明 Rad3ATR-Cds1Chk2 checkpoint 通路直接调控 DNA 复 制解旋酶 CMG 复合体。孔道春实验室发现：当 DNA 复制叉停顿后，Cds1Chk2 同时磷酸化 Cdc45 亚基上的三个丝氨酸残基（且这三个 Chk2/Chk1 磷酸化位点在不同物种中相对保守）。这三个丝氨酸残基的磷酸化导致  CMG 复制解旋酶活性深度降低。CMG 复制解旋酶活性的降低使得它不能脱离停顿复制叉，不能与被阻挡的DNA 聚合酶分开。这样，停顿的 DNA 复制体（Replisome）及复制叉的生化完整性得到了维持，从而阻止了停顿 DNA 复制叉的垮塌。

为什么停顿复制叉里的复制解旋酶与DNA 聚合酶会倾向于分开呢？这关联到两件事情：一是 DNA 复制体或 DNA 复制叉的基本生化特性；二是正常细胞生长过程中导致复制叉停顿的基本原因。DNA 复制体中，DNA Pol ε 负责合成前导链 （leading strand）合成, DNA Pol α 和 δ 负责后随链（lagging strand）合成。由于后随链的合成稍微滞后于 CMG 解旋酶介导的 DNA 链解开，导致后随链的 DNA 模板上恒定的出现一段约 200 核苷酸长度的单链DNA 区域。如果该单链DNA 区域有形成DNA 二级结构的序列，如 G4、三股链、发夹结构等，DNA 二级结构的形成就是一个大概率事件。形成的 DNA 二级结构会阻挡 DNA Pol α、δ 的移动，导致复制叉停顿。在酵母细胞的染色体 DNA 上，大约有 2000-4000 个能形成 DNA 二级结构的序列。在人细胞中，能形成DNA 二级结构的数目大约有数百万个（~75 万个 G4 结构，及数倍于G4 的三股链结构等）。因此，DNA 二级结构导致的复制叉停顿是一个经常发生的生物事件。在前导链或后随链的DNA 模板上, 如果有碱基损伤（每个人细胞每天有约 105 级别的这类损伤） 或化学修饰，也会阻挡 DNA Pol α、δ、ε（DNA 聚合酶的活性中心非常精巧，只能容纳 AT 或 GC 配对，但不能容纳 AC 或 GT 配对，以保证DNA 复制的精准性），导致复制叉停顿。当DNA 聚合酶被阻挡后，CMG 解旋酶还要往前移动，这样就会导致CMG 解旋酶与 DNA 聚合酶物理上的分开，导致复制叉垮塌。

经过上千个实验室 50 年的不懈努力，checkpoint 调控维持停顿DNA 复制叉稳定的核心机制最终得到了阐明。即，1）停顿复制叉不稳定、倾向于垮塌的根本原因是： 当 DNA 聚合酶被阻挡后，复制解旋酶与 DNA 聚合酶倾向于分开；2）checkpoint 调控维持停顿复制叉稳定的核心机制是：降低复制解旋酶的活性，阻止复制解旋酶脱离复制叉 或 DNA 聚合酶，维持两者之间在物理及生化功能上的紧密偶联，从而维持停顿复制叉稳定， 并保持它的生物学功能（图 2）。孔道春实验室于 2019 年发现的chromsfork 调控，通过提高停顿复制叉周围的染色质结构紧密程度，也是为了阻挡复制解旋酶脱离复制叉，以维持复制叉稳定 (Feng et al. (2019), PNAS, 116(29):14563- 14572)。